關(guān)于醫(yī)療器械已知可瀝濾物測定方法驗證及確認技術(shù)審查指導(dǎo)原則的相關(guān)介紹
- 最后修訂： 2019-11-29 15:06:06
?2019年10月28日國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《醫(yī)療器械已知可瀝濾物測定方法驗證及確認注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》，其目的是提出對醫(yī)療器械已知可瀝濾物測定方法研究的一般要求。本文通過對可瀝濾物的基本概念、測定意義、試驗條件、方法驗證等方面的介紹，并結(jié)合實際案例進行解析，供相關(guān)單位進行可瀝濾物研究時提供參考。
2019年10月28日國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《醫(yī)療器械已知可瀝濾物測定方法驗證及確認注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》，其目的是提出對醫(yī)療器械已知可瀝濾物測定方法研究的一般要求。本文通過對可瀝濾物的基本概念、測定意義、試驗條件、方法驗證等方面的介紹，并結(jié)合實際案例進行解析，供相關(guān)單位進行可瀝濾物研究時提供參考。
一、什么是可瀝濾物？
醫(yī)療器械的可瀝濾物（Leachables）是指醫(yī)療器械或材料在臨床使用過程中釋放出的物質(zhì)的統(tǒng)稱，一般包括滅菌殘留劑、工藝殘留物、降解產(chǎn)物以及材料中的單體及添加劑（如穩(wěn)定劑、抗氧化劑、增塑劑、著色劑）等。可瀝濾物分為根據(jù)相關(guān)信息識別的已知可瀝濾物（Target Leachables）和根據(jù)未知物研究體系鑒別的未知可瀝濾物(Unknown Leachables)）。
二、為什么要進行可瀝濾物測定？
在醫(yī)療器械產(chǎn)品與人體接觸并發(fā)揮作用的過程中，可瀝濾物也在或短期或長期地對人體產(chǎn)生包括生物安全性在內(nèi)的安全性方面危害，所以需要對醫(yī)療器械的可瀝濾物進行風(fēng)險評價。
另一方面，可瀝濾物的安全性研究也是醫(yī)療器械生物學(xué)評價工作的重要內(nèi)容，安全性研究的結(jié)果還可以用于支持產(chǎn)品或材料等同性判定、穩(wěn)定性研究等。
三、如何進行可瀝濾物安全性評價？
首先應(yīng)進行充分的信息收集以獲得可瀝濾物信息，收集的內(nèi)容一般包括器械的結(jié)構(gòu)及材料組成、來自原材料供應(yīng)商的信息、擬研究材料/器械的理化特性及與可瀝濾物相關(guān)的文獻信息、器械的生產(chǎn)工藝信息、已有的歷史數(shù)據(jù)庫信息、臨床應(yīng)用信息等。
如果可瀝濾物已知且為原材料或最終醫(yī)療器械生產(chǎn)過程中添加的添加劑，應(yīng)進一步確認該添加劑在原材料或最終醫(yī)療器械中的添加總量是否超過該已知可瀝濾物的允許限量。如為否，則一般無需對該可瀝濾物本身做進一步的研究。如果超過了允許限量，則應(yīng)通過浸提物和可瀝濾物研究（Extractable & Leachable Study，E&L Study）獲得可浸提物/可瀝濾物基本信息（Extractables or Leachables Profile）及其最大釋放量，并根據(jù)其允許限量形成完整的安全性評價報告。
值得注意的是，可瀝濾物來源可能不僅是器械原材料及工藝信息中提供的添加劑、單體、加工助劑本身，某些情況下，器械及其原材料在生產(chǎn)、貯存及使用等過程中產(chǎn)生的上述化學(xué)物質(zhì)的水解、降解或反應(yīng)產(chǎn)物等宜同時納入可瀝濾物風(fēng)險評估的考慮。
對于E&L研究、允許限量建立、安全性研究的方法及流程等，可參考后續(xù)《未知可瀝濾物評價方法建立及表征技術(shù)審查指導(dǎo)原則》《已知可瀝濾物允許限量建立技術(shù)審查指導(dǎo)原則》《毒理學(xué)關(guān)注閾值在醫(yī)療器械風(fēng)險管理中的應(yīng)用指南》等相關(guān)指南進行。
四、可瀝濾物研究的試驗條件如何確定？
可瀝濾物是臨床使用過程中從醫(yī)療器械或材料中釋放出的物質(zhì)統(tǒng)稱，因此通過可瀝濾物研究最能代表實際應(yīng)用過程中使用者的接觸量。但由于實際條件的挑戰(zhàn)（包括臨床接觸途徑及使用方法的多樣性和復(fù)雜性、臨床樣本采集的倫理問題等），對大部分器械來說，很難進行真正意義上的可瀝濾物研究，因此某些情況下宜通過浸提試驗（Extract Test）替代可瀝濾物研究。但是務(wù)必對浸提方式進行論述，證明浸提條件是嚴于或模擬了器械臨床最壞使用條件（包括浸提方式、溶劑、時間、溫度、流速等），具體可參考《醫(yī)療器械已知可瀝濾物測定方法驗證及確認注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》（2019年第78號）論述，此處不再展開。
五、分析測試方法是否一定要進行方法學(xué)驗證？
不一定。對于某些已經(jīng)建立起標準檢測方法的研究物質(zhì)，優(yōu)先選用標準方法，如國際標準、國家標準等，但申請人仍需對所申報產(chǎn)品采用上述國際標準、國家標準的適用范圍進行確認。對于無標準檢測方法的可瀝濾物研究，企業(yè)需開發(fā)新的檢測方法并進行方法學(xué)驗證及確認工作。
對于已經(jīng)建立合適的分析方法并進行驗證后，新的實驗室采用該方法進行檢驗前還應(yīng)進行方法比對性測試，以確保方法的轉(zhuǎn)移的可靠性。比對性測試需要考慮的因素包括樣品數(shù)量、濃度級別、重復(fù)次數(shù)等。
在某些情況下, 如原材料的合成工藝改變、分析方法發(fā)生改變等，企業(yè)應(yīng)進行充分的風(fēng)險評估，并根據(jù)評估結(jié)果考慮是否需要對分析方法再次進行全面的或部分的再驗證,以確保分析方法可行。
六、是否有可參考的案例？
對于已知可瀝濾物測定，企業(yè)可參考指導(dǎo)原則要求及附件中案例（附件），并根據(jù)企業(yè)擬研究產(chǎn)品/物質(zhì)的基本特點進行測定。
對于未知可瀝濾物測定，企業(yè)可參考隨后發(fā)布的其他相關(guān)指導(dǎo)原則。
附件：一次性使用聚氯乙烯輸血器中可瀝濾物鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）增塑劑的研究（下載）
附件：
一次性使用聚氯乙烯輸血器中可瀝濾物鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）增塑劑的研究
一、概述
DEHP，是Di-(2-ethylhexyl) phthalate的縮寫，全名為鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯。
分子式：C24H38O4
結(jié)構(gòu)式：
分子量：390.6
CAS編號：117- 81-7
物理狀態(tài)：常溫下為無色無臭液體。不溶于水，溶于乙醚、乙醇、礦物油等。
熔點：-50℃ 或-55℃
沸點:在5mm Hg時大約230℃ (BASF1994b;Clayoton 1981,in HSDB 2005)
在1013hP時385℃
蒸汽壓：0.000034 Pa在20℃
水溶性：0.003mg/L在20℃
醇溶性：>100mg/mL( 95%乙醇， 22℃)
密度：0.986g/cm3at20℃( IARC1982，in HSDB 2005)
由于聚氯乙烯（PVC） 材料本身質(zhì)地較硬且加工難度較大，為了使PVC制品柔軟往往加入大量的增塑劑。在常用的增塑劑中，DEHP由于其與優(yōu)異的增塑性能、易獲得性以及和PVC 的良好相容性，使得其在成為輸血器中最常見的增塑劑。
DEHP一般先與PVC樹脂以及其他添加劑通過共混等方式制備含有DEHP的PVC粒料，在此共混過程中，其不以共價鍵結(jié)合而是物理結(jié)合于PVC 分子上。一般來說，在軟質(zhì)PVC粒料中DEHP的質(zhì)量百分比可高達20%~50%。
注：材料組成及牌號等信息可能涉及企業(yè)專利等信息，此處省略。但在正式的遞交文件中應(yīng)予以明確（如適用）。
二、浸提液制備的論述
2.1總則
由于輸血器中的DEHP為脂溶性物質(zhì)，易溶于乙醇，其輸血器中含量可高達21.60%-33.37%。一次性使用輸血器在臨床上為只接觸血液的器械，對于材料中可瀝濾物DEHP的研究，原則上應(yīng)選擇血液作為浸提介質(zhì)，采用臨床相同使用條件進行滴注。由于難以收集足夠的血液或招募足夠的志愿者用于研究，因此使用血液或血液成分作為浸提介質(zhì)來評估器械釋放的DEHP不是很實際。因而需選擇一個合適的替代溶劑，本研究擬選擇密度為0.9373至0.9378g/mL的乙醇/水混合溶液作為替代浸提溶劑，為了驗證乙醇/水混合溶液的浸提能力嚴于血液，進行了以下試驗驗證。同時一次性使用塑料血袋的國際標準（ISO 3826-1）中采用密度為0.9373-0.9378g/mL的乙醇水混合物作為血液替代溶劑測定血袋中DEHP的釋放量。
2.2浸提能力的驗證
為了驗證乙醇/水混合溶液的浸提能力嚴于血液，收集來自三名健康志愿者的血液樣品，用EDTA鹽抗凝并儲存在玻璃容器中。這些血樣作為第一組用于模擬實際使用情況。第二組采用密度（ρ）為0.9378g/mL（20℃）的水/乙醇混合物在相同條件下浸提DEHP（相同的提取介質(zhì)體積，相同的滴落速率和相同的滴度、相同環(huán)境溫度）。測定結(jié)果見表1。
表1血液和水/乙醇混合物提取能力比較
血液 (DEHP 釋放量, mg)
乙醇/水 (DEHP 釋放量, mg)
1a
2a
3a
0.110
0.068
0.073
2.84
a: 數(shù)字1,2和3對應(yīng)于來自三名志愿者的全血樣品。
由上述結(jié)果可以看出乙醇/水混合溶液的提取能力遠高于血液。因而，對該產(chǎn)品選擇乙醇/水混合溶液作為浸提溶液。
解讀：應(yīng)結(jié)合器械臨床使用情況選擇合適的浸提方式，若選擇使用替代溶劑進行浸提，適用時，應(yīng)結(jié)合可瀝濾物的性質(zhì)通過論述或試驗方式證明，替代溶劑的浸提能力嚴于臨床接觸的介質(zhì)。
三、分析方法
3.1 儀器及參數(shù)：
氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫7890 GC和配備電子電離（EI）源和四極桿分析儀的安捷倫 5975C質(zhì)譜儀。
色譜柱:HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm，Agilent J＆W GC柱，USA）；
掃描方式：溶劑延遲時間3.5min，全掃模式45-450amu（定性）和選擇離子掃描m / z = 149（定量）；
分流模式：分流比5:1；流速:1.5mL / min；進樣量：1μL/樣品；
柱溫箱條件：起始溫度150℃，保持0.5分鐘，然后將以20℃/分鐘升至280℃，保持7分鐘。
3.2方法學(xué)驗證
3.2.1專屬性
分別取DEHP標準溶液、乙醇/水空白對照和正己烷溶劑進行分析。色譜圖如下：
圖1 SIM模式下DEHP標準溶液（10μg/ mL）的色譜圖
圖2 SIM模式下乙醇/水空白對照的色譜圖
圖3在SIM模式下篩選的正己烷試劑的色譜圖
由于各種鄰苯二甲酸酯的廣泛使用，使得其在環(huán)境中廣泛分布，如空氣、水、土壤、灰塵、沉積物、海產(chǎn)品和人體組織。在測試過程中，乙醇/水的空白對照有DEHP的響應(yīng)，但是因其響應(yīng)值較低不會對結(jié)果測定造成干擾。
解讀：確認試驗中所用到的溶劑體系及浸提液基質(zhì)均未對DEHP的測定產(chǎn)生影響。
3.2.2線性及范圍
以正己烷作為溶劑時，DEHP的線性范圍為0.1-200μg/ mL。 相關(guān)系數(shù)大于0.999。實際工作中應(yīng)根據(jù)待測物濃度選擇合適的工作標準曲線范圍。
解讀：DEHP血液接觸途徑TI值為0.6mg/kg/day，由于輸血器可用于嬰兒，按臨床最嚴格應(yīng)用人群計算，根據(jù)GB/T 16886.17，取嬰兒的默認體重為3.5kg, 則嬰兒的可耐受暴露量=2.1mg/day（0.6mg/kg/天*3.5）。嬰兒一天最大輸血量按臨床最差情況350mL計，則溶液中最低濃度為6μg/ mL。線性最低點0.1 μg/ mL可以滿足最具挑戰(zhàn)性人群的評價要求。
3.2.3重復(fù)性
為了驗證重復(fù)性，使用具有四種不同濃度水平的樣品溶液來表示0.1-200μg/ mL的線性范圍內(nèi)的高，中，低和極低濃度，并且在每種濃度重復(fù)測定3次。結(jié)果見表2。
表2 重復(fù)性驗證結(jié)果
濃度 (μg/mL)
乙醇/水（n=3）
RSD（%）
血液（n=3）
RSD（%）
極低 (0.1)
2.33
3.88
低 (1.0)
4.51
6.71
中 (10)
8.80
0.57
中（100）
7.16
2.24
高 (180,200a)
5.02
7.86
a: 乙醇/水和血液樣本中DEHP加入量分別為180μg/ mL和200μg/ mL
解讀：覆蓋線性范圍內(nèi)高、中、低三種濃度。
注：乙醇/水和血液樣本中部分較高濃度水平的3份樣品的測定RSD值在5.02%-8.80%之間，該結(jié)果來自乙醇/水和血液樣本的浸提溶液，樣本本底較為復(fù)雜，除此之外，該RSD值還涵蓋了樣本的真空干燥、復(fù)溶等復(fù)雜處理過程。同時考慮到對某些醫(yī)療器械，已知可瀝濾物的浸提結(jié)果本身存在個體差異，因而，本指導(dǎo)原則在考慮方法精密度時，描述為“同一份均勻供試品溶液，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度”，重點考察在“同一均勻供試品檢驗液”下，檢驗方法能夠達到的精密度。
3.2.4回收率
此外，采用回收率來評估方法的準確?；厥章蕼y定為測定5個不同濃度水平的加標樣品，每個濃度水平重復(fù)3次， 結(jié)果見表3。
表3 回收率驗證結(jié)果
加標濃度 μg/mL
回收率
乙醇/水 (n = 3)
血液 (n = 3)
回收率 (%)
RSD (%)
回收率 (%)
RSD (%)
0.1
94.23
2.33
92.43
3.88
1
94.23
4.51
91.04
6.71
10
101.53
8.80
98.90
0.57
100
89.58
7.16
98.15
2.24
180，200a
94.60
5.02
95.35
7.86
a: 乙醇/水和血液樣本中DEHP加入量分別為180μg/mL和200μg/mL
解讀：覆蓋線性范圍內(nèi)高、中、低三種濃度，并同時獲得樣本中精密度驗證結(jié)果。
3.2.5檢測限（LOD）和定量限（LOQ）
由于環(huán)境背景中存在的DEHP 背景水平影響LOD和LOQ評估。當使用經(jīng)過篩選并發(fā)現(xiàn)幾乎沒有背景DEHP的正己烷時，制備一系列極低濃度水平的DEHP標準品，采用信噪比法3：1和10：1估計LOD和LOQ，SIM模式下方法的LOD和LOQ分別約為1ng/mL和2.5ng/mL。然而由于乙醇/水中存在DEHP采用信噪比法評估可能不是很準確。因此本研究中關(guān)于LOD和LOQ值評估參考ICH Q2（R1）6.3和7.3中規(guī)定的方法，并分別使用如下計算公式：
其中δ=響應(yīng)的標準偏差，S =校準曲線的斜率
本研究通過進樣空白樣品（乙醇/水混合物和全血），每種空白樣本重復(fù)10次計算響應(yīng)的標準偏差來獲得δ值。 本研究中計算的LOD和LOQ值分別為：血液樣本為3.08ng/mL和9.35ng/mL，乙醇/水混合物為2.91ng/mL和8.81ng/mL。
試劑篩選結(jié)果表明，相同級別試劑可能存在不同的DEHP背景水平。 因此，可能需要在供應(yīng)商變更甚至批號更改時逐個報告DEHP的 LOD和LOQ值。
解讀：血液樣本和乙醇/水樣本中檢測限均可滿足臨床最挑戰(zhàn)應(yīng)用人群的毒理學(xué)評估要求。
3.3樣品測定結(jié)果
使用乙醇/水混合溶液和血液分別模擬臨床使用方式進行樣品制備，采用所建立的GC-MS方法測定對浸提液進行測定，測定結(jié)果見表5。
表5 樣品測定結(jié)果
產(chǎn)品名稱
浸提溶劑
DEHP釋放量，mg
一次性使用輸血器
乙醇/水混合溶液
2.84
血液
0.068-0.073
注：使用100mL提取介質(zhì)（水/乙醇混合物和血液）。試驗用血液來自三名健康志愿者
解讀：根據(jù)乙醇/水樣品液中濃度為：28.4 μg/mL，血液樣本中濃度為：0.68-0.73 μg/mL，線性范圍0.1 μg/mL -200 μg/mL，供試品溶液中測定濃度在線性范圍內(nèi)。
四、結(jié)論
本研究建立了GC-MS方法用于測定替代溶劑和全血中DEHP的量，產(chǎn)品中DEHP 的釋放量為2.84mg/套（乙醇/水混合溶液）。根據(jù)FDA DEHP安全性評估文件，腸外途徑的DEHP耐受攝入量（TI）值為0.6 mg / kg（體重）/天，取成人體重70 kg，兒童10公斤，新生兒3.5公斤（ISO 10993-17 2002）作為默認值。計算人體DEHP可耐受暴露量分別為：成人42毫克/天（0.6mg/kg/天*70），兒童6毫克/天（0.6mg/kg/天*10）和新生兒2.1毫克/天（0.6mg/kg/天*3.5）。測定結(jié)果均低于成人的可耐受暴露量，替代溶劑的結(jié)果大于新生兒的可耐受暴露量值。
解讀：如果選擇使用替代溶劑獲得的結(jié)果超過了可耐受暴露量值，則應(yīng)考慮使用臨床接觸的介質(zhì)重新進行研究。當然，在可行的情況下，也可以直接采用臨床接觸介質(zhì)進行可瀝濾物溶出量研究。